2025año9En enero, de varias instituciones, como el Departamento de Dermatología de la escuela de posgrado médica de la Universidad de kyoto.Naomi KitayamaEl equipo de investigación, enComunicaciones de Investigación Bioquímica y Biofísica"La revista publica el títuloTargeting PAR-2 in atopic dermatitis: Evaluación preclínica del nuevo inhibidor E6795Investigación. El estudio se centra en la dermatitis atópica..ADMecanismos patológicos que activan receptores a nuevas proteasas2()PAR-2) inhibidores de moléculas pequeñasE6795Se realizó una evaluación preclínica para explorar su mejoraADEfectos relacionados con la inflamación, la picazón y la disfunción de la barrera cutánea.

resumen

Dermatitis atópica..AD) es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel caracterizada por lesiones cutáneas similares al eccema, picazón severa y función dañada de la barrera cutánea. A pesar de la aparición de nuevos tratamientos, muchos pacientes todavía se enfrentan a problemas como el control insuficiente de la enfermedad, el alto costo del tratamiento y la recurrencia de la enfermedad. Receptor activado por proteasa2()PAR-2) enADLa sobreexpresión en las lesiones cutáneas juega un papel en la promoción de la respuesta inflamatoria, la producción de picazón y el desequilibrio de la homeostasis epidérmica. Este estudio proporcionaE6795Evidencia de estudios preclínicos, el compuesto es una pequeña molécula diseñada específicamente para apuntar a los procesos patológicos mencionados anteriormentePAR-2Inhibidores. Las quinasas y los análisis farmacológicos confirmaron,E6795Inhibición selectivaPAR-2, que muestra una interacción extremadamente baja fuera de objetivo en una amplia gama de paneles de detección de cinasas y farmacología. Además,E6795Mejora en ambos modelos de ratónADIndicadores de puntos finales relevantes, incluida la reducción de la respuesta inflamatoria y la infiltración de células inmunes; La administración oral reduce la pérdida de agua a través de la epidermis..TEWL) y2%Las preparaciones de crema local mejoran las manifestaciones histológicas y los síntomas de picazón relacionados con la función de barrera. El examen histológico confirmó que,E6795Después del tratamiento, la infiltración de células inflamatorias disminuyó y la función de barrera cutánea aumentó. Los resultados del estudio muestran que,E6795A través de la inhibición selectivaPAR-2Transmisión de señales, dirigida aADLos tres pilares de la Fisiopatología- -Disfunción de barrera, respuesta inflamatoria y picazón. Este estudio destacaE6795Como un nuevo tipo rentableADPotencial de los medicamentos terapéuticos locales.

ExperimentoMateriales e instrumentos

I) materiales experimentales

1. Animales de experimentación:11 - 12Zhou lingxiongNc / NgaRatones,6 - 14Hembras semanalesBALB/cRatones,6 - 10Zhou lingxiongC57BL/6JRatones.

2. Reactivos y anticuerpos:MC903,E6795,PAR-2Péptido agonistaSligkv - nh8322ndle;ySLIGRL-NH ₂, tripsina, trombina, cmc, dmso, uratán, varios anticuerpos marcados por fluorescencia,FLIPRReactivos de determinación del calcio, colagenasaIITipo,DNase I、10%Formalina, sumulina-Reactivo de teñido de rojo iraquí, reactivo de teñido de azul toluidina, etc.

3. Muestras de células y tejidos: riñón embrionario humanoHek293Células, muestras de piel de personas sanas,ADMuestra de piel de la lesión cutánea del paciente.

Ii) instrumentos experimentales

FDSS6000Sistema de detección de fluorescencia,FACS FortesaMedidor de flujo,FlujoSoftware, medidor de espesor, sistema de medición de arañazos,384Placa de almacenamiento de reactivos de polipropileno poroso,YoEl paquete de colágeno tipo 2 está cubierto de fondo transparente y Negro.384Placas de agujero, jaulas de ventilación, microscopios y sistemas de análisis de imágenes,ASCHEscaneo por evaporaciónMedidor de pérdida de agua percutánea

ASCH VAPOSCANMedidor de pérdida de agua percutánea

Proceso experimental

1. Experimentos celulares:Hek293Las células están en3%Suero bovino fetalDMEMCultivo en medio de cultivo, inoculado en384Carga trasera del agujeroFLIPRReactivos para la determinación del calcio, con diferentes concentraciones añadidasE6795Preprocesamiento30Minutos más, añadir Tripsina o trombina, pasarFDSS6000Monitoreo sistemático120Intensidad de fluorescencia en tiempo real en segundos, con cuatro parámetroslogísticaCálculo del modeloIC₅₀Valor.

2. Construcción y administración de modelos animales:

NaanMC903InducciónADModelo:BALB/cEl oído del ratón es continuo8Aplicación local del díaMC903De la sección4A partir del día, se tomará por vía oral todos los días.E6795La suspensión de CMC se administró al Grupo de control con el medio disuelto correspondiente.

NaanNc / NgagraveADModelo: tendrá dermatitisNc / NgaLos ratones se dividen en5Grupo, aplicación local diariaE6795Crema, persistente7Días, se estableció un grupo no tratado como control biológico.

3. Evaluación farmacodinámica:

Función de barrera cutánea: pasarASCHEscaneo por evaporaciónMedidor de pérdida de agua percutáneaMedidas No.0、3、7Pérdida de agua a través de la epidermis en el cieloValor()TEWL); El espesor de las orejas de los ratones se mide diariamente con un medidor de espesor.

ASCH VAPOSCANMedidor de pérdida de agua percutánea

()c）第3 Día y día7 La pérdida de agua a través de la epidermis del cielo..TEWL) Resultados de la prueba. En comparación con el Grupo de control de medios solubles,E6795La administración oral es la primera7 El cielo puede reducirse significativamenteTEWL. Los datos se expresan erróneamente en el promedio ± estándar (excepto el número8 Grupo de administración oral de Tiantiann = 3Fuera, el resto de gruposn = 4).* Después de la correcciónP < 0,05, en comparación con el Grupo de control de medios solubles (prueba dunitt)

NaanPrueba de comportamiento de picazón: en el artículo7cielo17: 00Al día siguiente07: 00Colocar a los ratones solos en una jaula de medición, después de2Después del período de adaptación de las horas, se registra a través del sistema de medición de arañazos12Frecuencia del comportamiento de rascado durante las horas.

NaanAnálisis histológico e inmunohistoquímico: el punto final del experimento recogió el tejido cutáneo del oído del ratón y lo preparó después de la fijación de formaldehído y el enterramiento de parafina.5 μmRebanadas, realizadasde H&ETeñido (observando la infiltración de células inflamatorias y el espesor de la epidermis), teñido de azul Toluidina (contando mastocitos) yPAR-2Tinción inmunohistoquímica; Las muestras de piel humana también se realizanPAR-2Prueba inmunohistoquímica.

NaanAnálisis de la citología de flujo: el tejido cutáneo del oído del ratón fue enzimático para preparar una suspensión unicelular, que fue teñida con anticuerpos marcados con fluorescencia y pasó porFACS FortesaDetección de eosinófilos, neutrófilos,CD4⁺TLa infiltración de subgrupos de células inmunes, como células y basófilos, los resultados se expresaron en el número absoluto de células por milímetro cuadrado de piel de oreja.

4. Estudio farmacocinético: detección en ratonesE6795Fracción libre de plasma, fracción libre de sangre entera y sangre-Relación pulpa, evaluando sus características de absorción y distribución sistémica.

5. Análisis selectivo: a través del panel selectivo de la quinasa yCEREPPanel de Unión farmacológica, detección1 μMy10 μMBajo la concentraciónE6795La inhibición de una variedad de quinasas, receptores y Canales iónicos se evalúa para evaluar su actividad de desenganche.

6. Análisis estadístico: usoGraphPad Prisma 7.03Software, con análisis de variación de un solo factor..ANOVA unidireccional) combinaciónDunnettPrueba comparativa múltiple paraα=0,05Como nivel de prueba, los datos se basan en la media±Error estándar..media±SEM) indica.

Conclusiones experimentales

1. E6795Potente y selectivoPAR-2Actividad inhibidora, en la determinación del flujo de calcio celularIC₅₀El valor es6,56 nM, síPAR-1No inhibe y tiene una actividad extremadamente baja en una amplia gama de quinasas y paneles farmacológicos.

2. Visualización de la FarmacodinámicaE6795Se puede absorber por vía oral, aunque la tasa de unión a proteínas plasmáticas es tan alta como97,5%Pero una pequeña cantidad de medicamentos libres puede desempeñar un papel terapéutico.

3. Confirmación InmunohistoquímicaADEn los queratinocitos del pacientePAR-2La expresión es mayor que en las personas sanas.

4. EnMC903InducidoADEn un modelo de ratón,E6795Tanto la administración oral como la local pueden reducir la infiltración de eosinófilos, y la administración oral puede reducirTEWLMejorar la función de barrera de la piel, y la administración local puede reducir el espesor de las orejas.

5. EnNc/Nga ADEn un modelo de ratón,2% E6795La crema puede reducir el espesor de la epidermis, la infiltración de mastocitos y el comportamiento de arañazos, y mejorar las manifestaciones histopatológicas relacionadas con la dermatitis.

6. E6795A través de la inhibición selectivaPAR-2Señal, objetivoADLos tres núcleos principales de la Fisiopatología (inflamación, picazón, disfunción de barrera) tienen el potencial de ser medicamentos terapéuticos locales rentables y mínimamente invasivos.