Debido a sus ventajas de amplia gama de resistencia a ácidos y álcalis, fuerte estabilidad química, alta resistencia mecánica y matriz compleja aplicable, la columna de polimerización ocupa una posición importante en el campo de la aplicación de la Cromatografía líquida (clar), como el análisis de alimentos, el monitoreo ambiental y la investigación y el desarrollo de medicamentos. Sin embargo, a medida que aumenta el número de usos, los contaminantes de la muestra (como proteínas, lípidos, materia orgánica fuertemente conservada, etc.) se absorben gradualmente en la superficie del relleno de la columna o bloquean el tamaño del agujero, lo que conduce a problemas como la disminución de la eficiencia de la columna, la disminución de la separación y la deriva del tiempo de retención. En comparación con el reemplazo directo de nuevas columnas cromatográficas, el tratamiento de regeneración científica puede restaurar eficazmente el rendimiento de la columna, prolongar la vida útil y reducir los costos de análisis. Este artículo clasifica sistemáticamente los tipos de contaminación de las columnas de polimerización, expone en detalle los métodos de regeneración específicos y los puntos clave de operación, y proporciona orientación técnica para las operaciones estandarizadas de laboratorio.
I. principios básicos y preparación previa para la regeneración de columnas de polimerización
El núcleo del tratamiento de regeneración es eluir los contaminantes seleccionando un sistema de disolvente adecuado sin destruir la estructura del relleno polimérico (como evitar la rotura de enlaces sin intersección y la deformación del tamaño del agujero), protegiendo al mismo tiempo la integridad del lecho de columna. Antes de llevar a cabo la regeneración, es necesario completar tres preparativos clave: primero, aclarar el tipo de contaminación y especular sobre la naturaleza de los contaminantes en combinación con el sustrato de la muestra, por ejemplo, las muestras biológicas a menudo contienen contaminantes proteicos, y las muestras ambientales pueden dejar residuos de materia orgánica altamente polar; El segundo es recopilar la información básica de la columna cromatográfica y consultar las instrucciones para confirmar el material de relleno (como poliestireno - divinilbenceno, polimetanoato, etc.), el rango de resistencia al disolvente y la presión de tolerancia (por lo general, la presión de tolerancia de la columna de polimerización es inferior a la de la columna de silicona y generalmente no supera los 20 mpa); El tercero es realizar la prueba de referencia de rendimiento de la columna y establecer la referencia de comparación de rendimiento antes y después de la regeneración determinando el número teórico de placas de torre, el grado de separación y el factor de simetría de las muestras estándar (como la muestra estándar mixta de benceno).
II. métodos de regeneración específicos basados en el tipo de contaminación
La contaminación de la columna de polimerización se puede dividir en contaminación de adsorción reversible y contaminación de deposición irreversible. es necesario seleccionar la estrategia de elución de acuerdo con el mecanismo de interacción entre contaminantes y rellenos. los métodos de regeneración comunes incluyen el método de elución de gradiente, el método de elución de disolvente específico y el método de regeneración compuesta.
I) regeneración por elución de gradiente de la contaminación por adsorción reversible convencional
Para los contaminantes con una intensidad de retención débil a moderada en la muestra (como la mayoría de los compuestos orgánicos de moléculas pequeñas y algunas impurezas polares), la intensidad de elución del disolvente se puede aumentar gradualmente mediante elución gradiente para lograr la desorción de contaminantes. Este método es adecuado para el mantenimiento rutinario de la contaminación leve diaria, y los pasos operativos específicos son los siguientes: primero, lavar 10 volúmenes de columna (cvs) de la columna con una fase móvil inicial (como el sistema metanol - agua) a un bajo flujo de 0,5 ml / MIN para eliminar las muestras residuales en la columna; Posteriormente, el gradiente proporcional aumenta la proporción de disolvente de elución fuerte, como la transición gradual de metanol - agua (50: 50, V / v) al metanol puro (100%), manteniendo un caudal de 0,8 ml / MIN para lavar 15 - 20cvs; si se utiliza el modo de cromatografía de fase inversa y el contaminante contiene componentes polares, se puede lavar aún más 10cvs Con metanol - nitrilo (50: 50, V / v) para mejorar el efecto de elución de contaminantes no polares; Finalmente, se equilibró 10 - 15 CVS con la fase de flujo inicial hasta que la línea de base se estabilizó. Este método tiene poco daño al relleno polimérico, y la tasa de recuperación de la eficiencia de la columna después de la regeneración suele alcanzar más del 85%.
(2) regeneración de disolventes específicos con una fuerte retención de contaminación orgánica
Cuando las muestras contienen hidrocarburos aromáticos policíclicos, ácidos grasos de cadena larga y otros compuestos orgánicos fuertemente conservados, la elución de gradiente convencional es difícil de eliminar, y es necesario utilizar un sistema de disolvente específico para destruir la Interacción hidrofóbica entre contaminantes y rellenos. Para las columnas de polimerización de poliestireno - divinilbenceno (ps - dvb), se recomienda el método de elución en tres pasos "metanol - tetrahidrofurano - metanol": Primero enjuagar 10 CVS con metanol puro para eliminar los residuos superficiales, luego enjuagar 20 - 30 CVS con tetrahidrofurano (thf) como eluyente fuerte, enjuagar 20 - 30 CVS a baja velocidad 0,3 ml / min y quitar Los contaminantes adsorbidos hidrofóbicamente utilizando la fuerte capacidad de disolución de thf; Debido a que el THF tiene un ligero efecto de hinchazón en el relleno polimérico, es necesario enjuagar posteriormente 15cvs en sentido inverso con metanol puro, reducir gradualmente el tamaño del agujero del relleno y eluir el THF residual; Finalmente, se equilibra con la fase móvil inicial. Si el contaminante es una sustancia polar fuerte (como un compuesto de aminoácidos), se puede agregar un 0,1% (tfa) al sistema de elución para debilitar la interacción polar ajustando el ph, pero hay que tener en cuenta que la concentración de TFA no debe exceder el 0,5%, y después de la regeneración, es necesario neutralizar y lavar el 5cvs con una solución de metanol que contiene 0,05% de amoníaco para evitar la corrosión residual ácida del lecho de columna.
(3) degradación enzimática de la contaminación biomacromolecular - regeneración compuesta por disolvente
Después del análisis de muestras biológicas (como suero, orina, extracto vegetal), las proteínas, ácidos nucleicos, Polisacáridos y otras macromoléculas biológicas son fáciles de adsorber firmemente en la superficie del relleno polimérico a través de acciones hidrofóbicas o enlaces de hidrógeno, e incluso forman depósitos en gel para bloquear los poros, y el efecto de elución del disolvente simple es limitado. En este momento, es necesario adoptar la estrategia de regeneración compuesta de "pretratamiento enzimático + elución con disolvente": primero se prepara una solución tampón que contiene proteasa (como tripsina, concentración de 0,1 mg / ml) (tampón fosfórico pH 7,0), se enjuaga la columna cromatográfica con un caudal de 0,2 ml / MIN 30 CVC y se deja reposar a una temperatura constante de 37 ° C durante 2 horas para que la enzima pueda degradar completamente los contaminantes proteicos; Posteriormente, enjuagar 10 CVS con una solución de agua de metanol al 5% para eliminar la enzima residual, y luego eluirla de acuerdo con el gradiente secuencial de "agua - metanol - nitrilo - metanol", enjuagar 15 CVS en cada etapa de disolvente, y el caudal se controla en 0,5 ml / min; Finalmente, se enjuaga el 5cvs (inhibir la reproducción microbiana) con una solución de metanol que contiene Azida de sodio al 0,01% y se sella con metanol puro. Regeneración de columnas biocontaminantes por este métodoEsto puede restaurar el número teórico de placas de Torre a más del 80% de la nueva columna.
(4) lavado y regeneración de la contaminación por sales y partículas
Cuando la fase móvil contiene sales amortiguadoras (como fosfato, acetato de amonio) o las muestras contienen partículas suspendidas, es fácil formar cristales de salinización o depósitos de partículas en la entrada de la columna, lo que resulta en un aumento anormal de la presión de la columna. La regeneración de este tipo de contaminación se centra en la "disolución de baja intensidad + lavado físico": primero conecte la columna cromatográfica en sentido inverso (evite que los contaminantes se empujen hacia las profundidades del lecho de la columna), lave el 20cvs a baja velocidad con agua ultrapura a 0,3 ml / min y disuelva la cristalización de sales; Si la presión de la columna sigue siendo alta, se puede lavar 15cvs con una solución de agua de metanol al 5% y utilizar la débil capacidad de elución del metanol para ayudar a eliminar partículas; Para las partículas obstinadas, se pueden lavar alternativamente tres ciclos con "agua - metanol - agua" para pelar los sedimentos a través de la fuerza de cizallamiento producida por los cambios en la viscosidad del disolvente. Hay que tener en cuenta que la presión no debe exceder la columna durante el lavado.Tolerancia al 80% de la presión y necesidad de conexión positiva después de la regeneración, equilibrada con la fase de flujo inicial a la estabilidad basal.
III. precauciones clave y evaluación de los efectos de las operaciones de regeneración
La estandarización de la Operación durante el proceso de regeneración afecta directamente el efecto de recuperación del rendimiento y la vida útil de la columna, y hay que seguir estrictamente cuatro principios: primero, controlar la velocidad y la presión, iniciar todo el proceso con una velocidad de flujo baja (0,3 - 0,8 ml / min), evitar el colapso del lecho de la columna causado Por una presión repentina, y el pico de presión no excede el límite superior estipulado en las instrucciones; El segundo es evitar mutaciones en el disolvente, cuando se cambian diferentes disolventes, se debe utilizar una transición de gradiente (por ejemplo, cuando se cambia de metanol a thf, se ajusta gradualmente la proporción de acuerdo con un gradiente del 10%) para evitar que las mutaciones en la polaridad del disolvente causen hinchazón desigual del relleno; El tercero es prohibir los disolventes tabú, como evitar el uso de cloroformo, Diclorometano y otros disolventes de hidrocarburos halógenos en columnas de polimerización de polimetacrilatos, y evitar la exposición a largo plazo a disolventes fuertemente alcalinos (ph > 12); El cuarto es sellar y proteger después de la regeneración, sellar con metanol puro o nitrilo cuando no se usa a corto plazo, y reemplazar regularmente el disolvente de sellado (cada tres meses) para el almacenamiento a largo plazo.
La evaluación del efecto de regeneración debe verificarse a través de tres indicadores básicos: el número teórico de placas de Torre (más del 50% más que antes de la regeneración es efectivo), el grado de separación (el grado de separación de los picos adyacentes se recupera a más del 1,5) y la desviación estándar relativa del tiempo de retención (rsd < 2%). Si después de varias regeneraciones, la separación de la muestra estándar sigue siendo inferior a 1,0 o la presión de la columna continúa aumentando más del 50% de la nueva columna, indica que la columna no se puede regenerar eficazmente y necesita ser reemplazada por una nueva columna.
IV. observaciones finales
El efecto de regeneración de la columna de polimerización depende de la precisión del juicio del tipo de contaminación y la adaptabilidad del método de regeneración. En el uso diario, se debe establecer un modelo de gestión de "prioridad preventiva y regeneración jerárquica": reducir la entrada de contaminantes a través del pretratamiento de muestras (como filtración y extracción), y realizar regularmente un mantenimiento de elución de gradiente leve; Para diferentes tipos de contaminación, se seleccionan con precisión estrategias de regeneración como enzimas y disolventes específicos, y se controlan estrictamente los parámetros de operación. El tratamiento científico de regeneración no solo puede reducir significativamente el costo de los consumibles de laboratorio, sino también garantizar la precisión y fiabilidad de los datos de análisis manteniendo la estabilidad del rendimiento de la columna, proporcionando un fuerte apoyo para el desarrollo eficiente del trabajo de análisis de cromatografía líquida.