En respuesta a la entrega genética de células difíciles de transferir, académicos de la Universidad Nacional de Singapur utilizaron la tecnología de vesículas de microcitos (mcpt) para crear un sistema de entrega genética quimérica. el estudio utilizó el exprimidor de lípidos de la compañía estadounidense genizer y publicó los resultados en la revista nanoscale. El nombre completo del texto original es: Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

En este estudio, el equipo de investigación de la Universidad Nacional de Singapur presentó un nuevo sistema de plataforma de entrega de genes quiméricos basado en la tecnología de vesículas de células microscópicas (mcpt). Este sistema de plataforma de entrega genética, formado por la fusión de membranas celulares y lípidos catiónicos, se utiliza para mejorar la eficiencia de la transfección de células difíciles de transferir (hard - to - Transform htt). La composición de la membrana celular de las vesículas de las células microcelulares da especificidad a la citosis de todo el complejo, lo que reduce la Citotoxicidad del complejo durante la transfección, mientras que los lípidos catiónicos son responsables de la Unión al material genético, al tiempo que proporcionan integridad estructural a los mcvts.

Antecedentes

La entrega genética es el proceso de introducir ADN extranjero en células eucariotas. Por ejemplo, la transmisión de genes terapéuticos o funcionales para alterar los procesos celulares en investigaciones básicas (como el descubrimiento de fármacos y estudios de mecanismos de proteínas funcionales) y aplicaciones clínicas (como la terapia génica). La transfección genética efectiva requiere no solo la introducción exitosa de ácidos nucleicos exóticos en las células, sino también su posterior transporte y expresión en las células. Esta es una tarea desafiante, ya que las moléculas de ADN en sí son cargadas negativamente, por lo que es difícil ser interiorizadas por las células en su forma convencional. Por lo tanto, hay un gran interés en el desarrollo de sistemas eficaces de transmisión genética. En las últimas décadas, se han explorado una gran cantidad de sistemas vectoriales, desde sistemas de entrega basados es es en virus hasta vectores no virales. Aunque la eficiencia de la transfección de los vectores de entrega genética no viral es relativamente baja, se espera que se convierta en seguridad y aceptación clínica, con sistemas lipídicos catiónicos y plataformas basadas en polímeros como ejemplos Principales. La Tabla 1 resume las principales ventajas y desventajas de los reactivos o métodos de transfección comúnmente utilizados en la actualidad.

El sistema ideal de entrega genética no viral debe ser capaz de entregar eficazmente las moléculas de ADN necesarias a tipos celulares específicos y tener la menor Citotoxicidad para garantizar la expresión máxima del gen objetivo. Sin embargo, por lo que sabemos, los reactivos de transfección actualmente disponibles en el mercado obviamente no cumplen con estos estándares, especialmente cuando se utilizan para transfundir células difíciles de transfundir (htt).

Las células htt suelen incluir células primarias, células madre embrionarias y algunas líneas de células inmortalizadas, como 3t3 - L1 (células grasas precursoras de ratón), u937 (células mononucleares humanas), Jurkat (linfocitos T humanos), huvec (células endoteliales de la vena umbilical humana), etc. Según las estadísticas, la eficiencia de la transfección de plásmidos de células htt con reactivos comerciales a menudo no supera el 25%. Una de las razones por las que las células htt tienen una baja tasa de absorción de sustancias exóticas y plásmidos es su baja actividad metabólica. Además, estas células suelen ser muy sensibles a las perturbaciones celulares causadas por los reactivos de transfección utilizados y pueden causar Citotoxicidad que eventualmente conduce a la muerte celular.

Recientemente, se ha prestado considerable atención a la posibilidad de que los sistemas de entrega de origen celular entreguen moléculas de carga activas al lugar objetivo hasta cierto punto de forma específica. De hecho, muchos estudios han explorado el uso de sistemas de entrega de fármacos derivados de monocitos (dds) para la entrega dirigida de fármacos de quimioterapia y ADN plasmídico (pdna) a tumores, o el uso de DDS derivados de glóbulos rojos para prolongar la circulación sanguínea y la entrega dirigida de PDNA a las células sanguíneas. Se especula que la retención de los componentes de membrana celular de las células madre dará a estos sistemas de entrega de medicamentos basados es es en células la capacidad de identificar células objetivo específicas, lo que puede promoverse eludiendo la capacidad de reconocimiento del sistema inmunológico del cuerpo.

A pesar de la gran importancia terapéutica, hasta ahora no se ha aprovechado en gran medida todo el potencial del DDS basado en células en términos de transmisión genética. Los desafíos clave que deben abordarse incluyen los engorrosos y de bajo rendimiento procesos de separación / producción de DDS de origen celular, como la forma de exosoma, y las técnicas subóptimas de carga / recombinación genética. Por lo tanto, aunque estos sistemas parecen tener ventajas en términos de apuntamiento en el interior, tienen grandes limitaciones en términos de rendimiento y eficiencia de carga de ADN p. Por lo tanto, para superar estas limitaciones, proponemos aquí el desarrollo de un nuevo sistema de entrega genética quimérica compuesto por componentes de membrana celular y lípidos catiónicos, los primeros para potenciar la interiorización de las células Diana y los segundos para potenciar la carga de ADN p.

En este estudio describimos el desarrollo de técnicas de vesículas de microcitos (mccvts), una nueva plataforma de entrega mixta obtenida por la fusión de lípidos catiónicos con membranas celulares. Para producir mcvts, las células se tratan primero con una solución de agua de baja permeabilidad para obtener células fantasma (cg sin Citosol en células organelares), como se describe en Goh y otros. La solución hipoosmótica forma una breve apertura en la membrana plasmática, lo que permite eliminar el contenido dentro de la célula, manteniendo la integridad de la membrana plasmática. CG de diferentes células suspendidas en medio acuático se utiliza para hidratar y secar la película lipídica dotap, que luego se exprime a través de un exprimidor lipídico, proporcionando un tamaño hidromecánico promedio similar al de los lipídicas dotap exprimidos y un mcvts con potencial zeta. En este estudio, demostramos que los mcvts son capaces de unirse al plasmídeo e interiorizarse por las células objetivo, con la menor citotoxicidad. Curiosamente, cuando los mcvts producidos a partir de diferentes tipos celulares se comparan in vitro, muestran una eficiencia de transfección significativamente mayor para los tipos celulares de los que provienen los mcvts.

Métodos y resultados

Se preparan células fantasma (cg sin plasma y membrana celular del organelo celular) para garantizar la repetibilidad y el Estado de Seguridad de los mcvts.

Métodos y resultados ligeramente

Producción y análisis de características de mcvts.

Al igual que la producción de lípidos, el método de película lipídica se utiliza para producir mcvts. La película dotap se hidrata con CG para formar grandes lípidos multimoleculares envueltos en cg. Esta suspensión se exprime y la pulpa del CG contiene lípidos dotap (como se muestra en la figura 3a). De acuerdo con el método establecido anteriormente por nuestro grupo, se demostró que después de la extrusión, los mcvts así producidos estaban compuestos por la fusión de lípidos y membranas cg. En general, la distribución del tamaño del CVT es similar a la de los lípidos. Para demostrar la solidez y versatilidad de este método en diversas líneas celulares, se han producido mccvts utilizando CG de diferentes líneas celulares, como algunas células htt (es decir, 3t3 - l1) y no cancerosas (es decir, hek293 y raw264.7). Como se muestra en la figura 3b, el tamaño hidrodinámico y el PDI de varios mccvts suelen estar dentro del rango de 400 nanómetros (pdi ~ 0,4), similares a los lípidos dotap (pdi ~ 0,2) producidos utilizando el mismo método de extrusión. En la figura 3c, se observan valores similares de potencial Zeta (unos + 30 MV a + 40 mv) en diferentes fórmulas, lo que indica que este método es generalmente adecuado para CG generado a partir de diferentes líneas celulares. curiosamente, cuando el mcvt3t3 - L1 se combina con el pdna, su distribución de tamaño es similar a la del mcvts no compuesto, mientras que el potencial Zeta general se convierte en negativo, lo que puede indicar un éxito de la combinación (ya que el PDNA cargado negativamente neutraliza el mcvts positivo).

Diagrama esquemático de A. cvts, que involucra la fusión de fantasmas celulares y lípidos hechos de películas hidratadas.

B. las diferentes mccvts y las dimensiones hidrodinámicas de mccvt3t3 - L1 con plásmidos se comparan con los lípidos dotap. Todos los cvts tienen un tamaño inferior a 500 nanómetros.

C. los diferentes mccvts y el potencial Zeta de mccvt3t3 - L1 con plásmidos en comparación con los lípidos dotap. Todos los mcvts tienen un potencial Zeta superior a + 30 mv, excepto el mcvt3t3 - L1 con ADN plasmídico (5 microgramos), que muestra un potencial Zeta negativo debido a la interacción con el ADN plasmídico. Los datos representan la media ± SD (n = 3).