Método de recuento celular:De la placa de conteo al contador automático de células

Muchos experimentos y pruebas comunes requieren que los científicos primero calculen con precisión el número o densidad de células. Estas operaciones incluyen un simple mantenimiento del Cultivo celular (como la transmisión celular) y experimentos cuantitativos (como qpcr). El recuento celular se puede hacer de varias maneras, y este artículo presentará estos métodos y sus ventajas y desventajas de manera integral.

1 Placa de recuento / células sanguíneascontarAparato

Uso de células sanguíneascontarAparatoCuando se limpia primero con un 70% de alcohol y papel de lentecontarAparatoLuego coloque suavemente la lámina de vidrio de cobertura sobre la placa de conteo. Si la lámina de vidrio de la tapa se coloca correctamente, se puede observar el fenómeno del anillo de Newton (patrón de color del anillo concéntrico). Tome una pequeña parte de la suspensión celular con una pipeta y coloque la pipeta en el borde de la placa de conteo para que la suspensión fluya a la Cámara de conteo a través de la acción capilar. Si es necesario detectar la actividad celular, Taipan Blue debe mezclarse en la suspensión celular en una proporción de 1: 1 antes de unirse a la Cámara de conteo.

Células sanguíneascontarAparatoEs un método temprano dedicado a obtener un recuento celular preciso, con una cuadrícula especial en la placa de conteo. Por lo general, la cuadrícula generosa es de 1 mm x 1 mm y se divide además en una cuadrícula pequeña de 0,05 mm x 0,05 mm. El borde de la Cámara de conteo está diseñado para fijar la vitrina de la cubierta a 0,1 mm por encima de la cuadrícula marcada, formando así una zona de volumen conocido.

Después de que el microscopio se centra en una zona de la Cámara de conteo, se utilizaContadorCuenta las células. Por lo general, se utiliza una zona de 1 milímetro cuadrado (100 nanolitros) y se cuenta con una lente de 4 o 10 veces, pero la selección específica depende del tamaño de la célula y la densidad en la suspensión. Este proceso suele repetirse en cuatro áreas diferentes de 1 mm cuadrado, y el resultado se toma como promedio. Si se detecta la actividad celular, se deben contar las células vivas y las células muertas, respectivamente, en las que las células muertas son teñidas de azul por el azul trippen debido al daño de la membrana.

Figura 1 sangreCélulasDiagrama esquemático de la cuadrícula de la placa de conteo

Ventajas y desventajas

El recuento manual es la forma de ahorrar presupuesto, pero también es el más largo y engorroso. Debido a errores humanos, especialmente cuando se realizan múltiples recuentos consecutivos, la fiabilidad es baja. Además, los recuentos frecuentes también pueden causar fatiga ocular. Si el laboratorio solo necesita contar ocasionalmente y no necesita alta precisión, entonces las células sanguíneasContadorEs una buena opción. Sin embargo, este método es insuficiente cuando se necesitan conteos frecuentes, mejoras de precisión o aplicaciones de alto rendimiento. Además, el recuento manual dificulta la distinción entre los diferentes tipos de células en la suspensión, a menos que el tipo de célula difiera significativamente en tamaño o forma.

2 Células automáticasContador

Células automáticasContadorEs una alternativa rápida, sencilla y automatizada al conteo manual. Se basan en células sanguíneasContadorCon el mismo principio, la operación se realiza contando las células varias veces dentro de un área conocida y tomando el promedio. Estos dispositivos también pueden distinguir entre células vivas y células muertas a través de métodos de exclusión de tintes como el azul de esperanza. Células automáticasContadorPuede ser un dispositivo independiente o conectarse a una computadora para su uso. La mayoríaContadorAdemás de proporcionar recuento celular, también se puede contar información como el tamaño de la célula.

Recuento de células fluorescentesMedidor(por ejemplo, luna - FL ™ Recuento de células de doble fluorescenciaMedidor) puede distinguir entre células vivas y muertas y utilizar tintes comunes (como acridina naranja e yoduro de propidina) para el recuento celular. Estos tipos de recuento celularMedidorTambién se ha destacado en el recuento de células en cultivos que pueden estar contaminados por fragmentos no celulares, como las células primarias, ya que los tintes pueden distinguir claramente las células.

Ventajas y desventajas

automáticoContadoradecuadoGeneralRecuento celular y detección de actividad. Es fácil de operar y de bajo costo, lo que reduce en gran medida la cantidad de trabajo de conteo manual. automáticoContadorPreciso y confiable, pero puede haber desafíos en el conteo de formas irregulares, muy pequeñas, suspensiones extremadamente delgadas o que contienen múltiples células que deben distinguirse. Para la mayoría de tipos y aplicaciones celulares, automáticoContadorProporciona un rendimiento de conteo eficiente.

3 CoulterContador

CoulterContadorNo se trata de un instrumento óptico, sino de contar las células midiendo los cambios en la resistencia de los microcanales. La resistencia de la célula es mayor que la de la solución electrolítica de suspensión, que aumenta brevemente a medida que pasa por el canal, un cambio que aumenta con el tamaño de la célula. CoulterContadorLa operación es similar a la automáticaContadorSin embargo, antes de usarlo, debe ejecutar la prueba en blanco y enjuagar el equipo después de usarlo.

Ventajas y desventajas

KurtContadorEs rápido y puede contar con precisión células de diferentes tamaños, por lo que se utiliza comúnmente en el recuento de células sanguíneas en hospitales. Sin embargo, no puede distinguir entre células vivas y muertas ni contar con precisión las células que forman racimos. Además, sus requisitos de mantenimiento son más altos.

4 Medidor de flujo

El medidor de flujo se utiliza generalmente para análisis celulares más detallados y está equipado con tecnología de detección fluorescente para detectar componentes celulares marcados. No todos los citometros de flujo permiten el recuento celular, pero los citometros de flujo con función de medición de volumen proporcionan un recuento celular altamente preciso y pueden distinguir el tipo de célula a través de anticuerpos marcados por fluorescencia.

Ventajas y desventajas

El citometro de flujo es potente, pero costoso, y suele ser de entre 40.000 y 100.000 dólares, por lo que rara vez se utiliza en recuentos celulares convencionales.

5 Otros métodos de recuento celular

La determinación espectral se utiliza ocasionalmente para estimar la densidad celularGrados. Debido a que las células son turbias, a medida que aumenta la densidad celular, la luz a través de la placa de Petri disminuye. Sin embargo, este método no es confiable porque el espectrómetro no cuenta directamente las células, solo mide la absorción y otras variables en la suspensión pueden afectar la absorción.

El método de cultivo es otro método de recuento que solo se aplica a las células que forman colonias (como bacterias). Después de diluir la suspensión celular y trazarla en una placa de petri, se cuenta el número de colonias para calcular la densidad celular de la suspensión original. Pero debido a la necesidad de esperar el crecimiento de las colonias, el método de cultivo es el método más lento.

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