Instrucciones técnicas del kit de prueba Elisa de Interferón gamma humano (ifn - gamma)

Kit de Elisa de Interferón gamma humano BS - 0033 (ifn - gamma)

I. principios de detección

Este Kit utiliza el método de doble sándwich de anticuerpos prueba de inmunoabsorción enzimática (elisa). Los anticuerpos monoclonales anti - ifn - gamma humanos se preenvasan en microporos y se añaden muestras, estándares y anticuerpos de detección marcados con biotina a su vez para formar un complejo de anticuerpos marcados con anticuerpos - antígenos - enzimas. Después del lavado, se unió la streptavidina - hrp marcada por la superóxidasa de rábano picante para colorear a través del sustrato tmb. La profundidad del color se relacionó positivamente con la concentración de ifn - gamma en la muestra, y la Absorbancia (valor de do) se determinó con un medidor de estándar enzimático para el análisis cuantitativo.

II. composición del kit

Componente 96 agujeros configuración 48 agujeros configuración condiciones de conservación

Placa microporosa preenvasada de 12 agujeros x 8 agujeros x 4 2 - 8 ℃.

Estándar liofilizado 1 tubo 1 tubo 2 - 8 ℃ (después de la resolución - 20 ℃)

Anticuerpos marcados con biotina 100 μl 100 μl 2 - 8 ℃ (protección contra la luz)

Estreptomicina - hrp 100 μl 100 μl 2 - 8 ℃ (protección contra la luz)

Diluyente de muestra 30 ML 15 ML 2 - 8 ℃.

20 × tampón de lavado 20ml 10ml 2 - 8 ℃.

Solución de sustrato tmb 10 ml 5 ML 2 - 8 ℃ para evitar la luz

Líquido de terminación 10 ml 5 ML 2 - 8 ℃.

Película de sellado 4 hojas y 2 hojas a temperatura ambiente

III. requisitos de la muestra

1. tipo de muestra

Suero / plasma‌ anticoagulante con EDTA o Heparina para evitar la hemólisis.

Sobrenadante de cultivo celular: centrifugación para eliminar partículas y evitar congelación y deshielo repetidos.

Otros líquidos biológicos: como líquido cefalorraquídeo, ascitis torácica, deben aclararse y detectarse.

2. procesamiento de muestras

Proporción de dilución: suero / plasma se recomienda diluir 1: 5 (muestra: diluyente = 1: 4), y el sobrenadante celular se recomienda diluir 1: 2.

‌ condiciones de conservación: conservación a corto plazo (≤ 7 días) a 2 - 8 ° c, y almacenamiento congelado en - 80 ° C en paquetes a largo plazo (evitar congelación y deshielo repetidos).

IV. pasos experimentales

1. preparación de reactivos

Detergente: diluir 20 × concentrado en 1 × líquido de trabajo (como 20 ml de concentrado + 380 ml de agua) con agua destilada.

Resolución estándar: el estándar liofilizado se agrega a 1 ml de diluyente estándar, se deja reposar durante 15 minutos y se distribuye en líquido madre de alta concentración.

Dilución gradiente: tomar 7 tubos ep, añadir 500 μl de dilución por tubo, transferir 500 μl del líquido madre a un tubo para mezclar bien, y diluir a su vez en relación doble (ejemplo: 1000 → 500 → 250 → 125 → 62,5 → 31,25 → 15625 pg / ml).

2. añadir muestras y calentar la educación

Añadir 100 μl de estándar o muestra diluida a cada agujero (se recomienda la prueba de rejuntado).

Conservar la luz y la temperatura a 37 ° C durante 90 minutos, y sellar la película de la placa.

3. lavado

Tirar todo el líquido del agujero, lavarlo tres veces con 1 × detergente, remojarlo durante 1 minuto cada vez y secarlo.

4. coloración y terminación

Añadir 100 μl de anticuerpos marcados con biotina a cada agujero (diluir con una dilución de anticuerpos 1: 100 con antelación) y criar a 37 ° C para evitar la luz y la temperatura durante 60 minutos.

Después del lavado, se añaden 100 μl de estreptomicina - hrp por agujero (diluido con una dilución ABC de 1: 100 por adelantado) y se cultiva a 37 ° C para evitar la luz y la temperatura durante 30 minutos.

Después del lavado, se añade 100 μl de líquido de sustrato tmb por agujero y se evita la luz y el color a 37 ° C durante 15 - 20 minutos.

Añadir 50 μl de líquido de terminación por agujero para terminar la reacción (la solución cambia de azul a amarillo).

5. determinación

El valor de od de la longitud de onda de 450 nm (longitud de onda de referencia 570 - 630 nm) se determina con un medidor estándar enzimático en 30 minutos.

V. cálculo de los resultados

La curva estándar se dibuja con la concentración del producto estándar como coordenada horizontal y el valor de od como coordenada vertical (ajuste de cuatro parámetros).

De acuerdo con el valor de od de la muestra, la concentración real se calcula a través de la ecuación de regresión, si la dilución de la muestra debe multiplicarse por el múltiplo de dilución.

VI. indicadores de rendimiento

Indicadores de parámetros

Sensibilidad ≤ 1,0 pg / ML

Rango de detección 15,63 – 1000 pg / ML

CVS en la placa de precisión inferior al 10%

Tasa de recuperación 83% - 113%

La especificidad no tiene reacciones cruzadas con il - 2 humano, IL - 4, etc.

VII. precauciones

Conservación del reactivo: las tiras no utilizadas deben sellarse y conservarse a 2 - 8 ° C para evitar la humedad; El líquido de sustrato tmb debe protegerse de la luz.

Procesamiento de muestras: evite el uso de muestras de Hemólisis e hiperlipidemia; Las muestras de alta concentración deben ser preexperimentales para determinar el múltiplo de dilución.

Especificaciones de operación:

Evite las burbujas de aire al agregar muestras, y la cabeza de la pistola debe reemplazarse.

El tiempo de incubación se controla estrictamente dentro del rango prescrito para evitar la evaporación.

Control de calidad: cada lote de experimentos debe tener un agujero en blanco (s0) y un control negativo.

Consejos de seguridad: para terminar con el ácido en el líquido, es necesario usar guantes para operar; Los residuos se tratan de acuerdo con los peligros biológicos.

Viii. vigencia

El kit tiene una validez de 6 meses a 2 - 8 ℃, y se recomienda que los productos estándar se empacen y congelen a - 20 ℃ después de abrir el sello.

Nota: lo anterior es solo para referencia. este producto es solo para investigación científica y no se utiliza como datos reales. los experimentos deben seguir estrictamente las instrucciones o consultar a los profesores técnicos.

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