Resumen: la ingesta de glucosa por corynebacterium glutamicum se realiza principalmente a través del sistema de fosfotransferasa de Manosa (pts) con alta afinidad por la glucosa (km = 0,35 mm). Se seleccionaron mutantes capaces de tolerar la 2 - desoxiglucosa (2dg) y la falta de actividad de transporte de glucosa dependiente de pep, capaces de crecer en medios con glucosa como única fuente de carbono y energía, y la tasa de ingesta de azúcar se redujo significativamente debido al sistema de ingesta no PTS de baja afinidad (ks = 11 mm). Creciendo en medios con diferentes presiones osmóticas, las células silvestres disminuyen la tasa de consumo específico de glucosa y la tasa de crecimiento específico. Las células de estos cultivos mostraron una actividad similar de PTS cuando se midieron en condiciones estándar. Sin embargo, la actividad de PTS se mostró relacionada con la presión osmótica cuando las células volvieron a suspenderse en un amortiguador de diferentes presiones osmóticas. Este efecto inhibidor puede explicar la disminución de la absorción de azúcar y la tasa de crecimiento observada en medios de fermentación de alta permeabilidad. Sin embargo, el sistema de transporte de glucosa no PTS no se ve afectado por la presión osmótica del medio de cultivo. En condiciones de producción industrial, se observó una inhibición similar de la capacidad de transporte de azúcar con el aumento correspondiente de la presión osmótica del medio de acumulación de glutamato. Este fenómeno limita así el proceso de fermentación, ya que la reducción de la tasa específica provoca un aumento de la proporción de azúcar consumida por el mantenimiento celular, acompañado de una reducción de la producción del producto.

Palabras clave: transporte de glucosa; Presión osmótica; Fermentación de ácido glutámico; Corynebacterium glutamicum;

Contenido de la investigación:

1. el efecto de la presión osmótica en la vitalidad del sistema de ingesta de glucosa PTS

La actividad de PTS se mantuvo constante dentro de la presión osmótica de 800mosmol / kg, y luego la actividad de PTS disminuyó linealmente con el aumento de la presión osmótica. La actividad de PTS a una presión osmótica de 1900 mosmol / kg es solo del 15% de la más alta.

2. efectos de la presión osmótica en la fermentación del ácido glutámico

La acumulación de Glutamato y metabolitos secundarios provoca un aumento significativo de la presión osmótica en el medio de cultivo, que se ve agravado aún más por la incorporación de bases (en este caso amoníaco) para mantener el pH constante. Este fenómeno se observa en la CEPA sensible a la temperatura de corynebacterium glutamicum 2262, que es capaz de alcanzar altas concentraciones de productos (glutamato > 85g / l) y una presión osmótica superior a 2000mosmol · kg - 1. La tasa de consumo de azúcar se mantuvo sin cambios durante las primeras horas y luego se

Disminuye gradualmente. Para comprobar si el debilitamiento de la actividad está relacionado con el aumento de la presión osmótica debido a la acumulación de glutamato, se midió la contribución de la actividad de PTS a la ingesta total de azúcar, que fue consistente en la medida en la bacteria Silvestre corynebacterium glutamicum atcc17965, es decir, 4,5 mmol.g-1.h-1. En las cepas productoras de glutamato, la ingesta total de azúcar es más rápida, lo que indica una mayor actividad de la enzima osmótica. Las tasas de ingesta de glucosa medidas en condiciones no estresantes indican que la enzima osmótica aporta hasta un 25% de la ingesta total de glucosa en corynebacterium glutamicum 2262. El efecto inhibidor del estrés osmótico sobre la actividad del PTS se determina de acuerdo con el método de medición in vitro del sistema de transporte del pts, y en condiciones de suplementos de glucosa (la contribución de la enzima osmótica es insignificante) (glucosa baja residual, es decir, inferior a 2G · L - 1), se puede ver que la disminución del consumo de glucosa es muy cercana a la disminución prevista de la actividad del PTS (figura 3a). cuando se utiliza la estrategia de suplementos de glucosa para mantener una alta concentración (50 G · L - 1), la mejora del consumo de glucosa puede deberse a la actividad de la enzima osmótica y la Alta saturación de glucosa presente en el reactor en el sistema (figura 3b). bajo esta barra, la alta tasa de consumo de glucosa conduce a la aparición temprana de metabolitos adicionales, como el ácido láctico.

3. efectos sobre el rendimiento del ácido glutámico

Una vez que aumenta la presión osmótica en el medio, una de las consecuencias de la disminución de la actividad metabólica es una disminución significativa de la producción de Glutamato al final de la fermentación. La disminución del consumo de glucosa provoca una disminución del rendimiento del Glutamato debido al aumento de la proporción de glucosa convertida en co2. La producción de CO2 se mantuvo aproximadamente constante durante toda la fase de producción, lo que indica que la obtención de energía bioquímica del Catabolismo azucarero para satisfacer la demanda de mantenimiento celular es constante, que es proporcional a la biomasa en el fermentador,

Por lo tanto, la reducción de la tasa de consumo específico de azúcar requiere aumentar la proporción de azúcar utilizado. La proporción de glucosa necesaria para el mantenimiento celular aumentó del 15% del consumo total de azúcar en la fase inicial de producción de Glutamato al 40% cuando la presión osmótica fue la más alta en la fase posterior a la fermentación, cuando se calculó utilizando el coeficiente de mantenimiento de corynebacterium glutamicum de 0,6 mmol de glucosa / células G / h (figura 4). La disminución de la producción de Glutamato observada en la fase posterior a la fermentación es consistente con los cambios en el flujo metabólico de carbono que mantienen la demanda. Según la reducción de la demanda metabólica de oxígeno durante el debilitamiento de la actividad metabólica, el control de la concentración de azúcar residual de acuerdo con los cambios de oxígeno puede restaurar parte de la pérdida de rendimiento.

4. debate

Este artículo muestra que la inhibición tardía de la fermentación del ácido glutámico está directamente relacionada con el efecto de control de la acumulación de productos y el entorno de penetración en la capacidad de absorción de azúcar. Este fenómeno no se debe a cambios en los niveles de expresión genética, sino a cambios en la actividad bioquímica del sistema de transporte bajo estrés osmótico. Además, este efecto es reversible, ya que una vez eliminado el estrés osmótico, las células lavadas todavía recuperan su capacidad de transportar azúcar. Del mismo modo, cuando se suspende en un amortiguador hiperosmótico, la capacidad de transporte de azúcar celular de crecimiento normal también se reduce significativamente. Con el aumento de la presión osmótica, este efecto fisiológico puede causar una disminución del consumo de azúcar y una desaceleración de la tasa metabólica. Debido a que los requisitos energéticos para mantener la biomasa se mantienen sin cambios y en muchos casos se necesita energía adicional para hacer frente a tales presiones, esto también provocará una disminución de la producción del producto. Cada vez se consume más azúcar para la producción de energía, por lo que se pierde en forma de dióxido de carbono a costa de reducir el producto. Para la fermentación del ácido glutámico, con el aumento de la presión osmótica del medio de cultivo, el rendimiento y el rendimiento disminuyeron significativamente. Los mecanismos bioquímicos que desencadenan la disminución de la capacidad de transporte de la proteína PTS aún deben determinarse, pero pueden estar relacionados con cambios estructurales en el complejo proteína / membrana. Las cepas que produzcan Glutamato de manera más eficiente o rápida alcanzarán el umbral de penetración más rápido, lo que provocará que la producción pueda no aumentar después de 24 horas de fermentación. Por lo tanto, la detección de cepas con alta resistencia a la presión es beneficiosa para la fermentación, asegurando así que las cepas industriales son lo suficientemente robustas como para mantener una alta actividad metabólica al obtener un alto rendimiento de productos. Otra vía para superar esta inhibición metabólica es desarrollar un sistema de fermentación capaz de integrar los procesos de extracción aguas abajo para eliminar los productos en la acumulación de fermentación.